茯苓鲨烯环氧酶基因克隆与表达分析

刘晓柳; 谢珍妮; 钟灿; 谢景; 张水寒; 金剑

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20230111

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茯苓鲨烯环氧酶基因克隆与表达分析

药学基础 | 更新时间：2023-01-17

- 茯苓鲨烯环氧酶基因克隆与表达分析
- Cloning and Expression Analysis of Squalene Epoxidase Gene in Poria cocos
- 中国实验方剂学杂志 2023年29卷第4期页码：144-152
- 作者机构：
  
  1.湖南中医药大学研究生院，长沙 410208
  2.湖南省中医药研究院中药资源研究所，长沙 410013
- 作者简介：
  
  刘晓柳，在读硕士，从事中药活性成分调控与分子生药学研究，E-mail：liu992482176@163.com
  金剑，博士，副研究员，从事中药生物技术与中药资源综合利用开发研究，E-mail：jinjian2016@163.com
- 基金信息：
  
  湖南创新型省份建设专项(2020SK2029;2022NK2005;2021JJ30420);长沙市杰出创新青年培养计划(kq2106084);湖南省药学一流学科
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20230111
  中图分类号： R284.2;R289;R22;R2-031;R33
- 收稿日期：2022-08-15，
  
  网络出版日期：2022-11-29，
  
  纸质出版日期：2023-02-20
- 稿件说明：
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刘晓柳,谢珍妮,钟灿等.茯苓鲨烯环氧酶基因克隆与表达分析[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(04):144-152.

LIU Xiaoliu,XIE Zhenni,ZHONG Can,et al.Cloning and Expression Analysis of Squalene Epoxidase Gene in Poria cocos[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(04):144-152.
刘晓柳,谢珍妮,钟灿等.茯苓鲨烯环氧酶基因克隆与表达分析[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(04):144-152. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230111.

LIU Xiaoliu,XIE Zhenni,ZHONG Can,et al.Cloning and Expression Analysis of Squalene Epoxidase Gene in Poria cocos[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(04):144-152. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230111.

摘要

目的

从茯苓中克隆参与茯苓三萜合成路径中的潜在关键限速酶鲨烯环氧酶（SE），并对其进行生物信息学及表达分析。

方法

采用试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，设计特异性引物，以cDNA为模板，进行

基因的克隆，对该基因进行生物信息学分析。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检查茯苓鲨烯环氧酶基因（

PcSE

）在茯苓神舟10号、湘靖28、5.78菌株中的表达。

结果

PcSE

的基因全长为1 571 bp，包含4个外显子，3个内含子。获得编码区域（CDS）序列长为1 413 bp，编码470个氨基酸。该蛋白为疏水性蛋白，无信号肽，有2个跨膜结构域，具有FAD/NAD（P）结合域和鲨烯环氧酶结构域，定位于线粒体或质膜上。与多孔菌科真菌的同源序列比对一致性为80.92%；系统进化树显示PcSE蛋白与美国茯苓的亲缘关系最近。Real-time PCR结果显示，

PcSE

基因在3个菌株中均有表达，在5.78菌株中的表达量最高，3个菌株的

PcSE

表达差异不存在统计学意义。

结论

首次从茯苓中克隆并分析茯苓

PcSE

基因，为进一步研究茯苓

PcSE

的功能及解析茯苓三萜生物合成途径提供了基础。

Abstract

Objective

To clone squalene epoxidase （SE）， a potential key rate-limiting enzyme involved in the synthesis pathway of

Poria cocos

triterpenes， from

P. cocos

and analyze for bioinformatics and expression.

Method

The total RNA was extracted by the kit and reverse-transcribed to cDNA. Specific primers were designed， and the cDNA was used as a template for cloning the

gene， which was analyzed for bioinformatics. The expression of

P. cocos

qualene epoxidase（

PcSE

） was examined by Real-time polymerase chain reaction（Real-time PCR） in

P. coco

Shenzhou No. 10， Xiangjing 28， and 5.78 strains.

Result

The full length of

PcSE

1 571 bp， containing four exons and three introns. The obtained CDS sequence is 1 413 bp， encoding 470 amino acids. This protein is a hydrophobic protein with no signal peptide structure and has two transmembrane structural domains with a FAD/NAD （P） binding domain and SE structural domain localized to the mitochondrial membrane and the plasma membrane. The homologous sequence alignment with fungi of the Poriferae family is 80.92%， and the phylogenetic tree shows that

PcSE

protein is most closely related to

P. cocos

from the US. The results of Real-time PCR showed that the

PcSE

was expressed in all three strains， with the highest expression in 5.78 strain， and there was no significant difference in

PcSE

expression among the three strains.

Conclusion

For the first time， the

PcSE

gene was cloned and analyzed from

P. cocos，

providing a basis for further research on the function of

PcSE

and the analysis of

P. cocos

triterpene biosynthesis pathway.

关键词

Keywords

references

金剑，刘浩，钟灿，等 . 茯苓的生物学认识与生产方式历史沿革［J］. 中国现代中药， 2020 ， 22 （ 11 ）： 1888 - 1895，1932 .

陈卫东，彭慧，王妍妍，等 . 茯苓药材的历史沿革与变迁［J］. 中草药， 2017 ， 48 （ 23 ）： 5032 - 5038 .

金剑，钟灿，谢景，等 . 我国茯苓炮制加工和产品研发现状与展望［J］. 中国现代中药， 2020 ， 22 （ 9 ）： 1441 - 1446 .

FENG G F ， ZHENG Y ， SUN Y ， et al . A targeted strategy for analyzing untargeted mass spectral data to identify lanostane-type triterpene acids in Poria cocos by integrating a scientific information system and liquid chromatography-tandem mass spectrometry combined with ion mobility spectrometry ［J］. Anal Chim Acta ， 2018 ， 1033 ： 87 - 99 .

ZHANG G ， WANG H ， XIE W ， et al . Comparison of triterpene compounds of four botanical parts from Poria cocos （Schw.） wolf using simultaneous qualitative and quantitative method and metabolomics approach ［J］. Food Res Int ， 2019 ， 121 ： 666 - 677 .

WANG W ， DONG H ， YAN R ， et al . Comparative study of lanostane-type triterpene acids in different parts of Poria cocos （Schw.） Wolf by UHPLC-fourier transform MS and UHPLC-triple quadruple MS ［J］. J Pharm Biomed Anal ， 2015 ， 102 ： 203 - 214 .

SHU S ， CHEN B ， ZHOU M ， et al . De novo sequencing and transcriptome analysis of Wolfiporia cocos to reveal genes related to biosynthesis of triterpenoids ［J］. PLoS One ， 2013 ， 8 （ 8 ）： e71350 .

JIN J ， DUPRE C ， YONEDA K ， et al . Characteristics of extracellular hydrocarbon-rich microalga Botryococcus braunii for biofuels production： Recent advances and opportunities ［J］. Process Biochem ， 2015 ， 26 （ 1 ）： 1 - 9 .

LIU Y ， ZHOU J ， HU T ， et al . Identification and functional characterization of squalene epoxidases and oxidosqualene cyclases from Tripterygium wilfordii ［J］. Plant Cell Rep ， 2020 ， 39 （ 3 ）： 409 - 418 .

于忠洋，姜洋，翟明霞，等 . 桑黄麦角甾醇生物合成关键酶P1ERG24基因克隆与表达分析［J］. 中草药， 2020 ， 51 （ 22 ）： 5825 - 5832 .

POLLIER J ， VANCAESTER E ， KUZHIUMPARAMBIL U ， et al . A widespread alternative squalene epoxidase participates in eukaryote steroid biosynthesis ［J］. Nat Microbiol ， 2019 ， 4 （ 2 ）： 226 - 233 .

王宝婕，朱灵英，周青青，等 . 野三七鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达［J］. 中国实验方剂学杂志， 2019 ， 25 （ 22 ）： 147 - 153 .

赵欢，郭娟，唐其，等 . 罗汉果角鲨烯环氧酶基因的克隆及表达分析［J］. 中国中药杂志， 2018 ， 43 （ 16 ）： 3255 - 3262 .

许燕，赵爽，董栩，等 . 滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究［J］. 中草药， 2017 ， 48 （ 9 ）： 1839 - 1844 .

孙蓉，罗吉，刘姗，等 . 金龙胆草鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达［J］. 基因组学与应用生物学， 2016 ， 35 （ 11 ）： 3141 - 3146 .

张艳敬，候志芳，梁韶，等 . 人参属药用植物三萜皂苷合成途径关键酶的研究进展［J］. 特产研究， 2016 ， 38 （ 2 ）： 53 - 57，70 .

祝传书，刘艳，蒲时，等 . 雷公藤4个环氧角鲨烯环化酶基因克隆与表达分析［J］. 农业生物技术学报， 2019 ， 27 （ 2 ）： 237 - 247 .

WANG J ， LI Y ， LIU D . Cloning and characterization of farnesyl diphosphate synthase gene involved in triterpenoids biosynthesis from Poria cocos ［J］. Int J Mol Sci ， 2014 ， 15 （ 12 ）： 22188 - 22202 .

WANG J R ， LIN J F ， GUO L Q ， et al . Cloning and characterization of squalene synthase gene from Poria cocos and its up-regulation by methyl jasmonate ［J］. World J Microbiol Biotechnol ， 2014 ， 30 （ 2 ）： 613 - 620 .

何海 . 茯苓磷酸甲羟戊酸激酶基因克隆及功能分析［D］. 武汉：华中农业大学， 2016 .

何海，郭继云，舒少华，等 . 茯苓细胞色素P450还原酶基因的克隆与生物信息学分析［J］. 中草药， 2016 ， 47 （ 16 ）： 2909 - 2915 .

郭继云 . 茯苓甾醇C-24甲基转移酶基因克隆与功能验证［D］. 武汉：华中农业大学， 2017 .

周振 . 茯苓羊毛甾醇合酶基因 PcLSS 克隆及其功能验证［D］. 武汉：华中农业大学， 2017 .

ZHANG X ， XU Z C ， XU J ， et al . Selection and validation of reference genes for normalization of quantitative real-time reverse transcription PCR analysis in Poria cocos （Schw.） Wolf （Fuling）［J］. Chin Med ， 2016 ， 11 ： 8 .

LIVAK K J ， SCHMITTGEN T . Analysis of relative gene expression data using Real-time quantitative PCR and the 2-DDCt method ［J］. Methods ， 2001 ， 25 （ 4 ）： 402 - 408 .

林龙 . 灵芝鲨烯环氧酶和八氢番茄红素合酶基因沉默对灵芝三萜合成及活性氧物质的影响［D］. 南京：南京农业大学， 2013 .

XU R ， FAZIO G C ， MATSUDA S P . On the origins of triterpenoid skeletal diversity ［J］. Phytochemistry ， 2004 ， 65 （ 3 ）： 261 - 291 .

WANG M ， CHEN D Q ， WANG M C ， et al . Poricoic acid ZA，a novel RAS inhibitor，attenuates tubulo-interstitial fibrosis and podocyte injury by inhibiting TGF- β /Smad signaling pathway ［J］. Phytomedicine ， 2017 ， 36 ： 243 - 253 .

HU S H ， ZHOU G ， WANG Y W ， et al . Tyrosinase inhibitory activity of total triterpenes and poricoic acid A isolated from Poria cocos ［J］. Chin Herbal Med ， 2017 ， 9 （ 4 ）： 321 - 328 .

LEE S R ， LEE S ， MOON E ， et al . Bioactivity-guided isolation of anti-inflammatory triterpenoids from the sclerotia of Poria cocos using LPS-stimulated Raw264.7 cells ［J］. Bioorg Chem ， 2017 ， 70 ： 94 - 99 .

WEN H ， WU Z ， HU H ， et al . The anti-tumor effect of pachymic acid on osteosarcoma cells by inducing PTEN and Caspase 3/7-dependent apoptosis ［J］. J Nat Med ， 2018 ， 72 （ 1 ）： 57 - 63 .

FENG G ， LI S ， LIU S ， et al . Targeted screening approach to systematically identify the absorbed effect substances of Poria cocos in vivo using ultrahigh performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ［J］. J Agric Food Chem ， 2018 ， 66 （ 31 ）： 8319 - 8327 .

LARANJEIRA S ， AMORIM-SILVA V ， ESTEBAN A ， et al . Arabidopsis Squalene Epoxidase 3 （SQE3） Complements SQE1 and Is Important for Embryo Development and Bulk Squalene Epoxidase Activity ［J］. Mol Plant ， 2015 ， 8 （ 7 ）： 1090 - 1102 .

GAO K ， XU J S ， SUN J ， et al . Molecular cloning and expression of squalene epoxidase from a medicinal plant， Bupleurum chinense ［J］ Chin Herb Med ， 2016 ， 8 （ 1 ）： 67 - 74 .

ALMEIDA A ， DONG L ， KHAKIMOV B ， et al . A single oxidosqualene cyclase produces the seco-triterpenoid α -onocerin ［J］. Plant Physiol ， 2018 ， 176 （ 2 ）： 1469 - 1484 .

SUZUKI H ， ACHNINE L ， XU R ， et al . A genomics approach to the early stages of triterpene saponin biosynthesis in Medicago truncatula ［J］. Plant J ， 2002 ， 32 （ 6 ）： 1033 - 1048 .

李彤，李剑超，王晨，等 . 药用植物鲨烯环氧酶基因研究进展［J］. 中国现代中药， 2021 ， 23 （ 10 ）： 1837 - 1841 .

陈新，徐丽，张力思，等 . 蓝莓角鲨烯环氧化酶基因的克隆与表达分析［J］. 山东农业科学， 2019 ， 51 （ 10 ）： 1 - 7 .

李晶，林雄杰，王泽辉，等 . 牛樟芝鲨烯环氧酶基因的克隆、生物信息学及表达分析［J］. 中草药， 2018 ， 49 （ 10 ）： 2440 - 2446 .

牛云云，朱孝轩，罗红梅，等 . 三萜皂苷合成生物学元件的初步开发：三七鲨烯环氧酶编码基因克隆及表达模式分析［J］. 药学学报， 2013 ， 48 （ 2 ）： 211 - 218 .

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