基于AMPK/Sirt1信号通路探讨身痛逐瘀汤含药血清对膝骨性关节炎大鼠软骨细胞的保护作用

王政臻; 黄俊卿; 杨彬; 李琳; 董佳安; 杨顺

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20230507

您当前的位置：

首页 >

文章列表页 >

基于AMPK/Sirt1信号通路探讨身痛逐瘀汤含药血清对膝骨性关节炎大鼠软骨细胞的保护作用

经典名方 | 更新时间：2023-07-18

- 基于AMPK/Sirt1信号通路探讨身痛逐瘀汤含药血清对膝骨性关节炎大鼠软骨细胞的保护作用
- Protective Effect of Shentong Zhuyutang-containing Serum on Chondrocytes in Rats with Knee Osteoarthritis Based on AMPK/Sirt1 Signaling Pathway
- 中国实验方剂学杂志 2023年29卷第16期页码：33-42
- 作者机构：
  
  1.河南中医药大学骨伤学院，郑州 450000
  2.河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院，郑州 450000
- 作者简介：
  
  王政臻，在读硕士，从事中医药防治脊柱和脊柱相关疾病的临床研究，E-mail：wzzn19@163.com
  黄俊卿，硕士，主任中医师，从事中医药防治脊柱和脊柱相关疾病的临床研究，E-mail：13939003396@139.com； *
  杨彬，硕士，副主任中医师，从事中医药防治脊柱和脊柱相关疾病的临床研究，E-mail：byang007@126.com
- 基金信息：
  
  2019年河南省中医药科学研究专项项目(2019JDZX095);全国中医临床特色技术传承人才项目(国中医药人教函〔2019〕36号)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20230507
  中图分类号： R2-0;R22;R285.5;R289;R33
- 收稿日期：2022-11-01，
  
  网络出版日期：2023-02-15，
  
  纸质出版日期：2023-08-20
- 稿件说明：
移动端阅览
王政臻,黄俊卿,杨彬等.基于AMPK/Sirt1信号通路探讨身痛逐瘀汤含药血清对膝骨性关节炎大鼠软骨细胞的保护作用[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(16):33-42.

WANG Zhengzhen,HUANG Junqing,YANG Bin,et al.Protective Effect of Shentong Zhuyutang-containing Serum on Chondrocytes in Rats with Knee Osteoarthritis Based on AMPK/Sirt1 Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(16):33-42.
王政臻,黄俊卿,杨彬等.基于AMPK/Sirt1信号通路探讨身痛逐瘀汤含药血清对膝骨性关节炎大鼠软骨细胞的保护作用[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(16):33-42. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230507.

WANG Zhengzhen,HUANG Junqing,YANG Bin,et al.Protective Effect of Shentong Zhuyutang-containing Serum on Chondrocytes in Rats with Knee Osteoarthritis Based on AMPK/Sirt1 Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(16):33-42. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230507.

摘要

目的

研究身痛逐瘀汤含药血清对膝骨关节炎（KOA）大鼠软骨细胞氧化应激及凋亡的保护作用。

方法

50只雄性大鼠分别灌胃给予生理盐水、身痛逐瘀汤低、中、高剂量（1.73、3.46、6.92 g·kg

-1

）和硫酸氨基葡萄糖（0.3 g·kg

-1

），连续给药2周后收集血清。构建KOA模型，分离软骨细胞，随机分为正常组、模型组、身痛逐瘀汤含药血清低、中、高剂量组及硫酸氨基葡萄糖组。软骨细胞培养过程中添加磷酸腺苷（AMP）依赖的蛋白激酶（AMPK）抑制剂Compound C（10 μmol·L

-1

），分为正常组、模型组、身痛逐瘀汤含药血清组、Compound C+身痛逐瘀汤含药血清组。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色检测细胞增殖；原位末端标记法（TUNEL）测定凋亡；DCFH-DA探针检测活性氧（ROS）水平；比色法测定谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、MMP-13、胶原酶Ⅱ型（Col Ⅱ）和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）mRNA表达水平；蛋白免疫印迹法（Weatern blot）检测磷酸化（p）-AMPK及沉默信息调节因子1（Sirt1）蛋白表达。

结果

与正常组比较，模型组软骨细胞增殖率、GSH活性、Col Ⅱ与Aggrecan mRNA表达、p-AMPK和Sirt1蛋白水平显著降低（

0.01），而ROS水平、MDA含量、TUNEL阳性细胞率、MMP-3与MMP-13 mRNA表达显著升高（

0.01）。与模型组比较，身痛逐瘀汤含药血清能提高KOA大鼠软骨细胞中EdU阳性细胞数、GSH活性、Col Ⅱ和Aggrecan mRNA表达水平、p-AMPK和Sirt1蛋白水平（

0.05，

0.01），而TUNEL阳性细胞率、ROS水平、MDA含量、MMP-3和MMP-13 mRNA表达水平则明显降低（

0.05，

0.01）。与身痛逐瘀汤含药血清组比较，Compound C+身痛逐瘀汤含药血清组细胞p-AMPK和Sirt1蛋白表达、GSH活性、Col Ⅱ和Aggrecan mRNA水平明显降低（

0.01），TUNEL阳性细胞率、ROS水平、MDA含量、MMP-3和MMP-13 mRNA水平显著升高（

0.01）。

结论

身痛逐瘀汤含药血清能减弱KOA大鼠软骨细胞氧化损伤，降低细胞凋亡，其保护作用可能与激活AMPK/Sirt1信号通路有关。

Abstract

Objective

To investigate the protective effect of Shentong Zhuyutang-containing serum against oxidative stress and apoptosis in chondrocytes of rats with knee osteoarthritis （KOA）.

Method

Fifty male rats were orally administered with normal saline， low-， medium-， and high-dose Shentong Zhuyutang （1.73， 3.46， 6.92 g·kg

-1

）， and glucosamine sulfate （0.3 g·kg

-1

） for two weeks. Serum samples were collected after the treatment period. The KOA model was established， and chondrocytes were isolated and randomly divided into normal group， model group， low-， medium-， and high-dose Shentong Zhuyutang-containing serum groups， and glucosamine sulfate group. During the chondrocyte culture， adenosine monophosphate （AMP）-activated protein kinase （AMPK） inhibitor Compound C （10 μmol·L

-1

） was added， and the cells were divided into normal group， model group， Shentong Zhuyutang-containing serum group， and Compound C + Shentong Zhuyutang-containing serum group. Cell proliferation was detected using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine （EdU） staining. Apoptosis was determined using terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling （TUNEL）. Reactive oxygen species （ROS） levels were measured using DCFH-DA probe. Glutathione （GSH） and malondialdehyde （MDA） levels were determined using the colorimetric method. Real-time polymerase chain reaction （PCR） was used to measure the mRNA expression levels of matrix metalloproteinase-3 （MMP-3）， MMP-13， type Ⅱ collagen （Col Ⅱ）， and Aggrecan. Western blot was performed to measure the protein expression of phosphorylated （p）-AMPK and silent information regulator factor 1 （Sirt1）.

Result

Compared with the normal group， the model group showed a significant decrease in chondrocyte proliferation rate， GSH activity， Col Ⅱ and Aggrecan mRNA expression， p-AMPK and Sirt1 protein levels （

0.01）， and increased ROS levels， MDA content， TUNEL-positive cell rate， and MMP-3 and MMP-13 mRNA expression （

0.01）. Compared with the model group， Shentong Zhuyutang-containing serum increased the number of EdU-positive cells， GSH activity， Col Ⅱ and Aggrecan mRNA expression， p-AMPK and Sirt1 protein levels in KOA rat chondrocytes （

0.05，

0.01）， and decreased the TUNEL-positive cell rate， ROS levels， MDA content， MMP-3 and MMP-13 mRNA expression （

0.05，

0.01）. Compared with the Shentong Zhuyutang-containing serum group， the Compound C + Shentong Zhuyutang-containing serum group showed significantly reduced p-AMPK and Sirt1 protein expression， GSH activity， Col Ⅱ and Aggrecan mRNA levels （

0.01）， and increased TUNEL-positive cell rate， ROS levels， MDA content， MMP-3 and MMP-13 mRNA levels （

0.01）.

Conclusion

Shentong Zhuyutang-containing serum attenuates oxidative damage and reduces apoptosis in chondrocytes of rats with KOA， and its protective effect may be associated with the activation of the AMPK/Sirt1 signaling pathway.

关键词

Keywords

references

胥少汀，葛宝丰，徐印坎 . 实用骨科学［M］. 北京：人民军医出版社， 2014 . 1679 .

王斌，邢丹，董圣杰，等 . 中国膝骨关节炎流行病学和疾病负担的系统评价［J］. 中国循证医学杂志， 2018 ， 18 （ 2 ）： 134 - 142 .

王波，余楠生 . 膝骨关节炎阶梯治疗专家共识（2018年版）［J］. 中华关节外科杂志：电子版， 2019 ， 13 （ 1 ）： 124 - 130 .

王柳，韩芮，谢俊雄，等 . RhoA/ROCK信号通路在骨性关节炎中的研究进展［J］. 中国疼痛医学杂志， 2020 ， 26 （ 5 ）： 331 - 336 .

徐斌，周明旺，李盛华，等 . JAK/STAT信号通路在骨关节炎致病机制及治疗靶点的研究进展［J］. 中国疼痛医学杂志， 2022 ， 28 （ 2 ）： 125 - 129 .

CHEN B ， ZHAN H ， MARSZALEK J ， et al . Traditional Chinese medications for knee osteoarthritis pain： A Meta-analysis of randomized controlled trials ［J］. Am J Chin Med ， 2016 ， 44 （ 4 ）： 677 - 703 .

阮洪生，刘树民 . 身痛逐瘀汤治疗骨伤科疾病临床研究进展［J］. 中国实验方剂学杂志， 2011 ， 17 （ 9 ）： 275 - 277 .

柴军红，于新，孔祥文，等 . 经典名方身痛逐瘀汤的基础与应用研究进展［J］. 中医药学报， 2022 ， 50 （ 10 ）： 101 - 108 .

易腾达，李玉丽，梁宇，等 . 经典名方身痛逐瘀汤的古今文献分析［J］. 中国实验方剂学杂志， 2021 ， 27 （ 2 ）： 28 - 36 .

陆梅，唐敏，刘莉敏 . 身痛逐瘀汤加减联合关节镜清理术治疗膝骨关节炎的临床疗效［J］. 临床合理用药杂志， 2021 ， 14 （ 27 ）： 154 - 156 .

周长春 . 身痛逐瘀汤加减治疗肾虚血瘀型膝关节骨性关节炎的临床研究［D］. 长春：长春中医药大学， 2015 .

孙鹏，李建，樊炜骏，等 . 独活寄生汤含药血清对膝骨性关节炎大鼠关节软骨细胞凋亡及GRP78，CHOP，HIRA及ASFla表达的影响［J］. 中国实验方剂学杂志， 2017 ， 23 （ 13 ）： 158 - 163 .

杨科，周祖山，何彦春，等 . 红景天苷通过激活Nrf2/HO-1通路减轻KOA大鼠软骨退变的作用机制研究［J］. 世界科学技术—中医药现代化， 2023 . doi： 11.5699.R.20221103.1812.011 http://dx.doi.org/11.5699.R.20221103.1812.011 .

李文雄，孙赫，沈玮，等 . SD大鼠骨关节炎造模方法的筛选及优化探究［J］. 畜牧与兽医， 2014 ， 46 （ 10 ）： 70 - 73 .

吴浩，孟志超，曹永平，等 . 内质网应激对膝骨关节炎大鼠关节软骨细胞的影响［J］. 中国组织工程研究， 2017 ， 21 （ 16 ）： 2502 - 2508 .

林陶秀，张文娟，张悦健，等 . 最佳中药含药血清浓度的筛选方法研究现状［J］. 中国实验方剂学杂志， 2023 ， 29 （ 2 ）： 195 - 202 .

NGUYEN U S ， ZHANG Y ， ZHU Y ， et al . Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis： Survey and cohort data ［J］. Ann Intern Med ， 2011 ， 155 （ 11 ）： 725 - 732 .

刘汉江，唐中尧，茶晓锋 . 中医综合治疗膝骨性关节炎临床疗效观察［J］. 现代医药卫生， 2013 ， 29 （ 12 ）： 1904 - 1905 .

娄玉钤，李满意 . “风湿病”的病名源流［J］. 风湿病与关节炎， 2013 ， 2 （ 1 ）： 37 - 41 .

谢育和 . 痹证学术思想源流的探讨与分析［D］. 广州：广州中医药大学， 2012 .

陈倩，黄小双，杨永晖，等 . 针刀调节Ca 2+ 抑制膝骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡的实验研究［J］. 中国中医基础医学杂志， 2022 ， 28 （ 10 ）： 1616 - 1623 .

WATANABE H . Aggrecan and versican： Two brothers close or apart ［J］. Am J Physiol Cell Physiol ， 2022 ， 322 （ 5 ）： C967 - C976 .

KRAWETZ R J ， WU Y E ， BERTRAM K L ， et al . Synovial mesenchymal progenitor derived aggrecan regulates cartilage homeostasis and endogenous repair capacity ［J］. Cell Death Dis ， 2022 ， 13 （ 5 ）： 470 .

温俊，谢志华，何志刚，等 . Aggrecan基因过表达载体对大鼠骨关节炎模型的影响［J］. 南昌大学学报：医学版， 2019 ， 59 （ 4 ）： 17 - 20，26，后插1.

徐传慧，潘昕，李超峰，等 . 骨关节炎患者血清中软骨代谢标记物与骨关节炎的关系研究［J］. 中国实验诊断学， 2019 ， 23 （ 2 ）： 273 - 275 .

BOUVIERE J ， FORTUNATO R S ， DUPUY C ， et al . Exercise-stimulated ROS sensitive signaling pathways in skeletal muscle ［J］. Antioxidants ， 2021 ， 10 （ 4 ）： 537 .

ARRA M ， SWARNKAR G ， KE K ， et al . LDHA-mediated ROS generation in chondrocytes is a potential therapeutic target for osteoarthritis ［J］. Nat Commun ， 2020 ， 11 （ 1 ）： 3427 .

JANG S ， LEE K ， JU J H . Recent updates of diagnosis， pathophysiology， and treatment on osteoarthritis of the knee ［J］. Int J Mol Sci ， 2021 ， 22 （ 5 ）： 2619 .

LYONS C L ， ROCHE H M . Nutritional modulation of AMPK-impact upon metabolic-inflammation ［J］. Int J Mol Sci ， 2018 ， 19 （ 10 ）： 3092 .

于辰曦，孙水 . AMPK在骨关节炎发生发展中的作用［J］. 生命的化学， 2016 ， 36 （ 6 ）： 842 - 846 .

MOHAMED J S ， HAJIRA A ， PARDO P S ， et al . MicroRNA-149 inhibits PARP-2 and promotes mitochondrial biogenesis via SIRT-1/PGC-1 α network in skeletal muscle ［J］. Diabetes ， 2014 ， 63 （ 5 ）： 1546 - 1559 .

MENZIES K J ， HOOD D A . The role of SirT1 in muscle mitochondrial turnover ［J］. Mitochondrion ， 2012 ， 12 （ 1 ）： 5 - 13 .

于斐，雷鸣，曾晖，等 . 高龄小鼠沉默信息调节因子1基因敲除后膝骨关节炎模型的建立［J］. 中国组织工程研究， 2015 ， 19 （ 49 ）： 7895 - 7901 .

MEI R ， LOU P ， YOU G ， et al . 17 β -estradiol induces mitophagy upregulation to protect chondrocytes via the SIRT1-mediated AMPK/mTOR signaling pathway ［J］. Front Endocrinol （Lausanne）， 2020 ， 11 ： 615250 .

浏览量

下载量

CSCD

文章被引用时，请邮件提醒。

提交

工具集

关联资源

黑逍遥散级联调控氧化应激和细胞凋亡对阿尔茨海默病大鼠的神经保护作用

苓桂术甘汤对心梗后慢性心衰大鼠线粒体分裂-融合及Sirt3/AMPK信号通路的影响

p38 MAPK通路在糖尿病周围神经病变中的作用及中药干预的研究进展

丹参-葛根提取物对氧糖剥夺/复氧损伤人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的保护作用

益肾生精方治疗少弱精子症的药效评价及作用机制