蜈蚣配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

许源升; 胡力; 蒋超; 赵玉洋; 陈天韵; 张辉; 田慧; 袁媛

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20231111

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蜈蚣配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

中药核酸检测技术体系的应用专题 | 更新时间：2024-01-15

- 蜈蚣配方颗粒的位点特异性PCR鉴别
  增强出版
- Identification of Scolopendra Dispensing Granules by Allele-specific PCR
- 中国实验方剂学杂志 2024年30卷第4期页码：48-54
- 作者机构：
  
  1.广西中医药大学，南宁 530200
  2.中国中医科学院中药资源中心，北京 100700
  3.华润三九现代中药制药有限公司，广东深圳 518029
- 作者简介：
  
  许源升，在读硕士，从事中药资源与鉴定学研究，E-mail：xuyuansheng2022@163.com
  蒋超，副研究员，从事中药分子鉴定研究，Tel：010-64087649，E-mail：jiangchao0411@163.com
  袁媛，研究员，博士生导师，从事中药鉴定与分子生药学研究，Tel：010-64087649，E-mail：y_yuan0732@163.com
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金项目(82073972);中央本级重大增减支项目(2060302);中国中医科学院科技创新工程项目(C12021A041;C12021B014)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20231111
  中图分类号： R284.2;R289;R287;R22;R2-031;R33;R24
- 纸质出版日期：2024-02-20，
  
  网络出版日期：2023-09-01，
  
  收稿日期：2023-05-08，
- 稿件说明：
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许源升,胡力,蒋超等.蜈蚣配方颗粒的位点特异性PCR鉴别[J].中国实验方剂学杂志,2024,30(04):48-54.

XU Yuansheng,HU Li,JIANG Chao,et al.Identification of Scolopendra Dispensing Granules by Allele-specific PCR[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2024,30(04):48-54.
许源升,胡力,蒋超等.蜈蚣配方颗粒的位点特异性PCR鉴别[J].中国实验方剂学杂志,2024,30(04):48-54. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20231111.

XU Yuansheng,HU Li,JIANG Chao,et al.Identification of Scolopendra Dispensing Granules by Allele-specific PCR[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2024,30(04):48-54. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20231111.

摘要

目的

为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量与临床疗效，建立蜈蚣配方颗粒特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴别方法。

方法

根据蜈蚣细胞色素C氧化酶亚基3（COX-3）基因序列筛选适用于蜈蚣配方颗粒的稳定引物区间，并在区间内筛选获得蜈蚣及其混伪品的单核苷酸多态性（SNP）位点，设计特异性鉴别引物。分别收集蜈蚣及其混伪品，考察退火温度、循环次数、不同

Taq

酶、DNA模板量、不同PCR仪、不同引物量等因素对PCR鉴别方法的影响，建立并优化PCR反应体系，并对此方法的专属性及适用性进行考察验证。

结果

PCR鉴别反应体系为2×M5 PCR Mix 12.5 μL，蜈蚣配方颗粒鉴别引物（10 μmol·L

-1

）各0.4 μL，DNA模板2.5 μL，无菌双蒸水9.2 μL。PCR反应参数为94 ℃预变性3 min，循环反应30次（94 ℃变性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃延伸5 min。利用上述PCR反应体系和反应参数对蜈蚣药材及其制品进行扩增，电泳检测结果表明所有正品均可在约135 bp处显示出一条明亮条带，而混伪品无条带。

结论

建立的特异性PCR鉴别方法可准确对蜈蚣药材、饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒中间体、配方颗粒成品进行准确鉴别，为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量具有重要意义。

Abstract

Objective

To establish an allele-specific polymerase chain reaction （PCR） method for identifying Scolopendra dispensing granules， so as to ensure the quality and therapeutic effects of Scolopendra and its preparations.

Method

The primer interval suitable for the PCR was selected based on the cytochrome c oxidase subunit 3（COX-3） gene sequence of Scolopendra， and the single nucleotide polymorphism （SNP） loci of Scolopendra

and its adulterants were mined from the interval for the design of specific primers. The samples of Scolopendra and its adulterants were collected. The PCR system was established and optimized regarding the annealing temperature， cycles，

Taq

enzymes， DNA template amount， PCR instruments， and primer concentrations， and the specificity and applicability of this method were evaluated.

Result

The PCR system was composed of 12.5 μL 2×M5 PCR Mix， 0.4 μL forward primer （10 μmol·L

-1

）， 0.4 μL reverse primer （10 μmol·L

-1

）， 2.5 μL DNA template， and 9.2 μL sterile double distilled water. PCR parameters： Pre-denaturation at 94 ℃ for 3 min， 30 cycles （94 ℃ for 20 s， 62 ℃ for 20 s， 72 ℃ for 45 s）， and extension at 72 ℃ for 5 min. After PCR amplification with the system and parameters above， the electrophoresis revealed a bright band at about 135 bp for Scolopendra and no band for the adulterants.

Conclusion

The established allele-specific PCR method can accurately identify the medicinal materials， decoction pieces， and standard decoction freeze-dried powder of Scolopendra， as well as the intermediates and final products of Scolopendra dispensing granules， which is of great significance for ensuring the quality and clinical efficacy of Scolopendra and its preparations.

关键词

蜈蚣配方颗粒单核苷酸多态性（SNP）位点聚合酶链式反应

Keywords

Scolopendradispensing granulessingle nucleotide polymorphism （SNP） locuspolymerase chain reaction （PCR）

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