波形蛋白与肝细胞癌的关系及健脾益气方的干预作用

王超; 音金萍; 蒋筱; 卓少元

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20221614

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波形蛋白与肝细胞癌的关系及健脾益气方的干预作用

药理 | 更新时间：2023-04-13

- 波形蛋白与肝细胞癌的关系及健脾益气方的干预作用
- Correlation Between Vimentin and Hepatocellular Carcinoma and Intervention Effect of Jianpi Yiqi Prescription
- 中国实验方剂学杂志 2023年29卷第10期页码：123-133
- 作者机构：
  
  1.广西中医药大学基础医学院，南宁 530200
  2.广西中医药大学广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室，南宁 530200
- 作者简介：
  
  王超，博士，主管技师，从事肝癌的中医药防治研究，E-mail：wangc@gxtcmu.edu.cn
  卓少元，教授，博士，硕士生导师，从事肝癌的中医药防治研究，E-mail：sherwin_zhuo@126.com
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金地区科学基金项目(81860824);广西中医药大学“桂派杏林拔尖人才”项目(2022C004);广西中医药大学2018年博士科研启动基金项目(04B1803616)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20221614
  中图分类号： R285;R289;R22;R2-031;R33
- 收稿日期：2022-05-26，
  
  网络出版日期：2022-10-13，
  
  纸质出版日期：2023-05-20
- 稿件说明：
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王超,音金萍,蒋筱等.波形蛋白与肝细胞癌的关系及健脾益气方的干预作用[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(10):123-133.

WANG Chao,YIN Jinping,JIANG Xiao,et al.Correlation Between Vimentin and Hepatocellular Carcinoma and Intervention Effect of Jianpi Yiqi Prescription[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(10):123-133.
王超,音金萍,蒋筱等.波形蛋白与肝细胞癌的关系及健脾益气方的干预作用[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(10):123-133. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20221614.

WANG Chao,YIN Jinping,JIANG Xiao,et al.Correlation Between Vimentin and Hepatocellular Carcinoma and Intervention Effect of Jianpi Yiqi Prescription[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(10):123-133. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20221614.

摘要

目的

研究波形蛋白（Vimentin）与肝细胞癌（HCC）的关系及健脾益气方通过Vimentin调控肝癌的分子机制。

方法

利用基于肿瘤基因组图谱计划（TCGA）和临床蛋白质组肿瘤分析协作组（CPTAC）数据库在线分析平台、STRING数据库及Cytoscape软件分析Vimentin与肝细胞癌的关系。随机将SD大鼠分为正常组、模型组、健脾益气方低、中、高剂量组（5.25、10.5、21 g·kg

-1

）、信号转导蛋白及转录激活子3（STAT3）抑制组（C188-9，4.5 mg·kg

-1

）和糖蛋白130（gp130）抑制组（SC144，4.5 mg·kg

-1

），每组10只。除正常组外，其余各组大鼠按照70 mg·kg

-1

体质量腹腔注射二乙基亚硝胺（DEN）复制肝癌模型。造模成功后，正常组和模型组大鼠生理盐水灌胃，健脾益气方低、中、高剂量组分别给予对应剂量中药灌胃，2个抑制组分别腹腔注射对应抑制剂，每日1次，连续4周。末次处置后，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）法检测大鼠肝组织中Vimentin mRNA水平；比色法检测肝组织胱天蛋白酶-3（Caspase-3）酶活性；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肝组织中Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶1（ROCK1）、Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶2（ROCK2）、aurora激酶B（AURKB）、锌指蛋白148（ZNF148或者ZBP-89）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）、总Vimentin、磷酸化Vimentin（p-Vimentin）及肝组织细胞核中Vimentin蛋白含量；酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测大鼠血清中Vimentin的含量。

结果

VIM mRNA在肝癌患者不同病理分期（Ⅰ~Ⅳ期）、不同病理分级（G

级）、无区域淋巴结转移患者（N0）和肝癌不同亚型患者组织中表达水平均显著升高（

0.01）；Vimentin蛋白水平在肝癌组织中显著降低（

0.01）；VIM基因有4处突变可以导致Vimentin蛋白一级结构的改变，这些遗传突变可降低患者无病生存期（

0.01）；VIM mRNA的表达水平与HCC纯度呈负相关（

0.01），而与微环境中肿瘤相关成纤维细胞、M2型巨噬细胞和髓系树突状细胞等的浸润水平呈正相关（

0.01）。关联分析结果显示Vimentin与STAT3在HCC患者肝癌组织中的表达存在一定相关性（

0.01）。动物实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肝组织中VIM mRNA、总Vimentin、p-Vimentin和核Vimentin蛋白水平、血清中分泌型Vimentin水平、肝组织中ROCK2、AURKB、STAT3和p-STAT3蛋白水平均显著上调（

0.01）；负调控分子ZBP-89蛋白水平显著降低（

0.01）；Caspase-3酶活性升高、ROCK1蛋白表达水平增加，但是差异无统计学意义。STAT3抑制剂和gp130抑制剂及中、高剂量健脾益气方均可显著降低大鼠血清中分泌型Vimentin水平，肝组织中总Vimentin、p-Vimentin和核Vimentin蛋白水平，及STAT3/Vimentin信号通路主要相关分子STAT3、p-STAT3、ROCK2、AURKB的蛋白水平，上调负调控分子ZBP-89蛋白水平和Caspase-3酶活性（

0.05，

0.01），且中剂量或高剂量健脾益气方对VIM mRNA水平、STAT3蛋白、ZBP-89蛋白、ROCK2蛋白和AURKB蛋白水平，Caspase-3酶活性的干预结果，与STAT3抑制剂比较差异均不具有统计学意义。

结论

Vimentin是肝癌组织中一种重要的炎症分子，其表达、细胞定位和功能可能受肿瘤相关成纤维细胞、M2型巨噬细胞和髓系树突状细胞浸润水平，以及白细胞介素（IL）-6/STAT3信号通路、特别是STAT3分子的影响；而健脾益气方可能通过干预STAT3/Vimentin信号通路调控Vimentin而防治肝癌。

Abstract

Objective

To study the correlation between Vimentin and hepatocellular carcinoma （HCC） and the mechanism of Jianpi Yiqi prescription against HCC through Vimentin.

Method

Correlation between Vimentin and HCC was analyzed based on the cancer genome atlas（TCGA）， clinical proteomic tumor analysis consortium（CPTAC）， STRING， and Cytoscape. SD rats were randomized into normal group （normal saline，

， once/day， 4 weeks）， model group （normal saline，

， once/day， 4 weeks）， low-dose， medium-dose， and high-dose （5.25， 10.5， 21 g·kg

-1

，

， once/day， 4 weeks） JianpiYiqi prescription groups， signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3） inhibition group （C188-9， 4.5 mg·kg

-1

，

， once/day， 4 weeks）， and glycoprotein 130 （gp130） inhibition group （SC144， 4.5 mg·kg

-1

，

， once/day， 4 weeks）， 10 rats in each group. Diethylnitrosamine （DEN， 70 mg·kg

-1

body weight，

） was injected in rats except the normal group to induce HCC. After the modeling， administration began. After last administration， Real-time polymerase chain reaction（Real-time PCR） was performed to determine Vimentin mRNA level in rat liver tissue. Caspase-3 activity in liver tissue was detected by colorimetry， and expression of Rho kinase （ROCK）1， ROCK2， aurora kinase B （AURKB）， Zinc-finger protein 148 （ZNF148）/zinc-binding protein-89 （ZBP-89）， STAT3， p-STAT3， total Vimentin， and phosphorylated （p）-Vimentin in liver tissue and Vimentin in liver tissue nucleus detected by Western blot. Serum Vimentin concentration was measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.

Result

Vimentin mRNA level was high in tissues from HCC patients with different cancer stages （stage Ⅰ-Ⅳ）， different pathological grades （G

-G

）， no regional lymph node metastasis （N0）， and different subtypes （

0.01）. Vimentin mRNA expression was higher in tissues from patients with lymph node metastasis than in patients without lymph node metastasis and normal samples. Vimentin protein level was decreased in HCC tissues （

0.01）. Vimentin gene has 4 mutations which can induce change in the primary structure of Vimentin protein and patients with Vimentin gene mutation had short disease free survival time （

0.01）. The mRNA expression of Vimentin was negatively associated with HCC cell purity （

0.01） but was positively associated with the infiltration levels of cancer-associated fibroblasts， M2 macrophages， myeloid dendritic cell and other immune cells in tumor microenvironment （

0.01）. Association analysis results showed that the expression of Vimentin was correlated with the STAT3 expression in HCC tissues （

0.01）. As for the animal experiment， Vimentin mRNA level and protein levels of total Vimentin and p-Vimentin in liver tssue， Vimentin protein level in liver tissue nucleus， Vimentin in rat serum， ROCK2， AURKB， STAT3 and p-STAT3 in liver tissues were up-regulated （

0.01） and protein level of negative regulator ZBP-89 was reduced in the model group （

0.01） compared with those in the normal group. Activity of Caspase-3 in liver tissue increased and the ROCK1 protein level was increased in the model group compared with those in the normal group. STAT3 inhibitor， gp130 inhibitor， and medium-dose and high-dose Jianpi Yiqi prescription all can reduce the secretory Vimentin protein in serum， protein levels of total Vimentin and p-Vimentin in liver tissues， and Vimentin in liver tissue nucleus， and the protein levels of STAT3/Vimentin signaling pathway-related molecules， such as STAT3， p-STAT3， ROCK2， and AURKB and up-regulate the protein level of negative regulator ZBP-89 and activity of Caspase-3 （

0.05，

0.01）. Effect of medium-dose or high-dose Jianpi Yiqi prescription on Vimentin mRNA expression， STAT3 protein expression， ZBP-89 protein expression， ROCK2 protein expression， AURKB protein expression and Caspase-3 activity was not significantly different from that of STAT3 inhibitor.

Conclusion

Vimentin， an important inflammatory molecule， is closely related to the occurrence and development of HCC and its expression， subcellular location and function may be affected by cancer-associated fibroblasts， M2 macrophages， myeloid dendritic cell， and IL-6/STAT3 signaling pathway， particularly by STAT3 molecule. Jianpi Yiqi prescription may exert therapeutic effect on HCC via regulating Vimentin through the STAT3/Vimentin signaling pathway.

关键词

Keywords

references

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